Una nueva y poderosa herramienta para la edición génica en bacterias Gram-negativas

El desarrollo de CRISPR/Cas9 como herramienta para la edición génica ha generado una verdadera revolución en la manera en que llevamos a cabo modificaciones en el genoma de distintas especies inaugurando una nueva era de la ingeniería genética. Esta tecnología se ha aplicado exitosamente tanto en eucariotas como en procariotas para insertar, reemplazar, modificar y/o eliminar genes. Combinada con la deaminasa APOBEC1, la cual permite el cambio específico de C:G→T:A, CRISPR/Cas9 constituye lo que se conoce como editor de bases, el cual es capaz de generar modificaciones al nivel de nucleótidos individuales. A pesar de los avances significativos que se han realizado en la última década, existen aún desafíos por superar para la implementación de esta tecnología, en especial para el estudio de microorganismos no convencionales como Pseudomonas putida o el patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa. Con el objeto de superar estas limitaciones, en nuestro trabajo desarrollamos una serie de herramientas de ingeniería genética basadas en CRISPR/Cas9 para facilitar manipulaciones en el ADN de bacterias Gram negativas. El avance e innovación de este sistema se basa en primer lugar en la adaptación de un editor de bases para obtener una eficiencia de edición >90%. Posteriormente, con la incorporación de la endoribonucleasa Cas6f para el procesamiento de ARN, se amplió el sistema para la edición simultánea de más de 10 genes con una eficiencia >85%. Así, mediante el desarrollo de un protocolo simplificado para el diseño de los ARN guías y su ensamblado, el sistema de edición de bases desarrollado en este trabajo se puede utilizar tanto para aplicaciones biotecnológicas como en estudios de la biología fundamental de bacterias claramente ampliando el uso y versatilidad de la tecnología CRISPR/Cas9.

El trabajo, titulado “Modular (de)construction of complex bacterial phenotypes by CRISPR/nCas9-assisted, multiplex cytidine base-editing”, ha sido publicado recientemente en la revista Nature Communications por sus autores Daniel C. Volke, Román A. Martino, Ekaterina Kozaeva, Andrea M. Smania y Pablo I. Nikel. Los Dres. Daniel C. Volke y Ekaterina Kozaeva, que forman parte del grupo del Dr. Pablo I. Nikel, y el Dr. Román A. Martino, del grupo de la Dra. Smania, llevaron adelante un proyecto de colaboración internacional que concluyó con el desarrollo de esta innovadora herramienta de biología sintética. El laboratorio dirigido por la Dra. Smania forma parte del Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (CIQUIBIC-CONICET), en la Universidad Nacional de Córdoba. El grupo dirigido por el Dr. Pablo I. Nikel, Microbiología Ambiental de Sistemas, se encuentra en The Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability perteneciente a la Universidad Técnica de Dinamarca.

¿Qué significa esta nueva herramienta para los investigadores?

En la actualidad, las herramientas de ingeniería genética con los que contamos para la edición génica o genómica en microorganismos pertenecientes, por ejemplo, al género Pseudomonas, son lentos y tediosos e implican mucho trabajo en la construcción de los vectores y posteriormente en el aislamiento de clones individuales en los cuáles la intervención ha sido exitosa. Estas limitaciones ralentizan los proyectos de investigación, especialmente cuando el resultado depende de la modificación de más de un solo gen. Si esta limitante la extrapolamos a un número mayor, la construcción de un fenotipo más complejo que requiera la edición de, por ejemplo, 10 genes tomaría mucho tiempo (varios meses). Este nuevo sistema de edición de bases múltiple basado en el procesamiento del ARN por la endoribonucleasa Cas6f permite a los investigadores editar >10 genes simultáneamente en un único paso sin por ello comprometer la eficiencia del proceso. La construcción del vector pMBEC, que supone el punto de partida para este tipo de modificaciones, es económica y rápida gracias a un protocolo de pocos pasos que automatiza el diseño de los oligonucléotidos y se basa en el clonado por Golden Gate, el cual emplea una sola enzima de restricción de clase II. Minimizar los costos, aumentar la eficiencia y reducir los tiempos de clonado son aspectos primordiales que hacen así accesible la tecnología a todos los grupos de investigación.

¿Qué es un editor de bases?

Un editor de bases está compuesto por una Cas9 modificada para producir un solo corte en una de las hélices del ADN doble cadena, y una deaminasa, la proteína APOBEC1, la cual cataliza la escisión del grupo amina de una base citosina dando lugar a un intermediario uracilo, el cual posteriormente será reemplazado por la base timina durante la replicación del ADN. De esta manera, Cas9 reconoce y emplea al ARN guía para localizar una región en el genoma complementaria al espaciador, adyacente a un patrón de reconocimiento NGG, abre la doble hebra de ADN volviendo accesible las citosinas para ser modificadas, y la APOBEC1 procede a deaminarlas (Fig. 1). Posteriormente, durante la replicación del genoma, la ADN polimerasa reemplaza el intermediario dUTP por dTTP fijando la mutación.

Fig. 1. El editor bases descrito en nuestro trabajo. (A) El ARN guía (ARNg) se expresa bajo un solo promotor y es procesado posteriormente por Cas6f para liberar las ARNg individuales. Esto permite que se editen simultáneamente lugares distantes en el genoma. (B) Un Cas9 deficiente (nCas9) es guiado por un único ARN guía (ARNg) a la secuencia protoespaciadora. La citidina desaminasa APOBEC1, fusionada con la nCas9, convierte la citosina en uracilo dentro de una ventana de edición; la dUTP se transforma posteriormente en dTTP durante la replicación del ADN. Esta estrategia se puede aplicar para uno o múltiples genes simultáneamente y así lograr la construcción de fenotipos bacterianos específicos.

¿Cómo se ensambla el pMBEC?

En un primer paso, cada espaciador de 20 pb se incorpora por PCR al extremo 5' de una secuencia corta compuesta por el ARN guía (ARNg) seguida de la secuencia de reconocimiento de Cas6f denominada Cas6f-loop. Luego, cada una de las PCR se insertan dentro del vector pMBEC, del cual existen 4 versiones con resistencias a diferentes antibióticos para poder emplearlos en diferentes microorganismos. Para el ensamblado del pMBEC, una sola PCR o múltiples PCR se ensamblan mediante Golden Gate en un único paso. La posterior selección del constructo se simplificó incorporando una proteína fluorescente (msfGFP) en el sitio de múltiple clonado flanqueada por secuencias de reconocimiento para la enzima BsaI (Fig. 2). La ausencia de fluorescencia en una rápida inspección visual facilita el identificar los constructos positivos. Para automatizar el diseño de los oligonucleótidos para el ensamblado del pMBEC, en la página de la publicación, como material suplementario, se puso a disposición un script para que los investigadores puedan analizar las secuencias genómicas de diferentes microorganismos en busca de los espaciadores. Luego, mediante el uso de la herramienta GoldenGate_PrimerDesigner, que se encuentra a disposición en la página web del laboratorio del Dr. Pablo I. Nikel (http://www.sem-cfb.com/index.html), se pueden obtener inequívocamente las secuencias de los oligonucleótidos a partir de cada espaciador seleccionado. Estos simples pasos para la selección de los espaciadores y el diseño de los oligonucleótidos minimizan los posibles errores de diseño. Por último, se optimizó el curado del plásmido pMBEC mediante el gen sacB para facilitar múltiples ciclos de edición tras la confirmación y el análisis de los fenotipos bacterianos resultantes.

Fig. 2. Construcción del pMBEC. El protocolo se simplificó para que la construcción de un ADN con múltiples espaciadores sea eficiente y rápida. La secuencia espaciadora de 20 pb se agrega por PCR a la secuencia guía (ARNg) y a la secuencia de reconocimiento de Cas6f (Cas6f-loop). En los extremos 5' y 3' de cada PCR se encuentran secuencias de alta eficiencia para el clonado por Golden Gate. El proceso completo permite editar >10 genes simultáneamente con una eficiencia >85%.

Los resultados publicados en nuestro trabajo ilustran como esta nueva herramienta para edición de bases supera las limitaciones que presentaban hasta el momento las demás tecnologías empleadas para ingeniería genética y genómica en Pseudomonas, y potencia los programas de ingeniería en bacterias Gram negativas. Este novedoso sistema CRISPR y los protocolos relacionados para la ingeniería microbiana no solo beneficiarán al amplio campo de la microbiología básica y aplicada, sino que también proporcionarán una comprensión más profunda de los mecanismos de edición de genes mediada por sistemas CRISPR en bacterias.

El grupo dirigido por el Dr. Pablo I. Nikel, Microbiología Ambiental de Sistemas, se
encuentra en The Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability perteneciente
a la Universidad Técnica de Dinamarca. En la foto los autores Daniel C. Volke, Andrea
M. Smania, Pablo I. Nikel y Ekaterina Kozaeva. (Foto tomada por Katrine Shouboe)

El laboratorio dirigido por la Dra. Smania forma parte del Centro de Investigaciones en
Química Biológica de Córdoba (CIQUIBIC-CONICET), en la Universidad Nacional de
Córdoba. En la foto, dos de los autores, Andrea M. Smania y Román A. Martino. (Foto
tomada por Carlos Mas)